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UV1700PC紫外可見分光光度計測定蛋白質含量方法

組成蛋白質的基本單位是氨基酸，氨基酸通過脫水縮

合形成肽鏈，蛋白質是一條或多條多肽鏈組成的生物大分

子。不同品種應針對自身蛋白質特性選擇適宜的測定方法

并做相應方法學驗證，同時應盡可能選用與待測定品種蛋

白質結構相同或相近的蛋白質作對照品。

*法凱氏定氮法

本法系依據蛋白質為含氮的有機化合物，當與硫酸和

硫酸銅、硫酸鉀一同加熱消化時使蛋白質分解，分解的氨

與硫酸結合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸

液吸收后以硫酸滴定液滴定，根據酸的消耗量算出含氮

量，再將含氮量乘以換算系數，即為蛋白質的含量。

本法靈敏度較低，適用于0.2?2. O m g氮的測定。氮

轉化成蛋白質的換算系數因蛋白質中所含氨基酸的結構差

異會稍有區別。

供試品溶液的制備照各品種項下規定的方法制備，

生物制品按如下方法操作。

精密量取供試品（如供試品為凍干制劑或固體粉末

時，應復溶后量取）適量，用0.9%氯化鈉溶液定量稀

釋，制成每l m l中含氮量約l m g的溶液，精密量取lml,

作為總氮供試品溶液進行測定。非蛋白氮供試品溶液的制

備，除另有規定外，照附注項下鎢酸沉淀法操作，即得。

測定法除另有規定外，按測定法（1 ) 操作，生物

制品按測定法（2 ) 操作。

(1) 本測定法適用于不含無機含氮物質及有機非蛋白

質含氮物質的供試品。精密量取各品種項下規定的供試品

溶液適量，置凱氏定氮瓶中，照氮測定法（通則0704第

二法或第三法）測定供試品溶液的含氮量。除另有規定

外，氮轉換為蛋白質的換算系數為6. 25。

(2) 本測定法適用于添加無機含氮物質及有機非蛋白

質含氮物質的供試品。除另有規定外，精密量取各品種項

下規定的總氮及非蛋白氮供試品溶液適量，分別置凱氏定

氮瓶中，照氮測定法（通則0704第二法或第三法）測定，

以__________總氮量減去非蛋白氮量即為供試品溶液的含氮量。除另

有規定外，氮轉換為蛋白質的換算系數為6. 25。

【附注】非蛋白氮供試品溶液制備常用方法

鎢酸沉淀法精密量取供試品（如供試品為凍干制劑

或固體粉末時，應復溶后量取）適量（蛋白質含量不高于

0. 2 g ) ,置20ml量瓶中，加水10ml，加10%鎢酸鈉溶液

2.0ml，0. 33mol/L硫酸溶液2ml，加水至刻度。或精密

量取上述供試品2ml，加水14.(ftnl，10% 鎢酸鈉溶液

2.0ml，0.33mol/L硫酸溶液2. Oml。搖勻，靜置3 0分鐘，

濾過，棄去初濾液，取續濾液，即得（可依據蛋白質濃度

適當調整1 0 %鎢酸鈉溶液及O.33mol/L硫酸溶液用量，

使鎢酸終濃度保持1% )。

三氯醋酸沉淀法精密量取供試品（如供試品為凍干

制劑或固體粉末時，應復溶后量取）適量（蛋白質含量

6?12mg)，加等體積的1 0 %三氯醋酸溶液，混勻，靜置

3 0分鐘，濾過，棄去初濾液，取續濾液，即得（可依據

蛋白質濃度適當調整1 0 %三氯醋酸溶液用量，使三氯醋

酸終濃度保持5% )。

第二法福林酚法（Lowry法）

本法系依據蛋白質分子中含有的肽鍵在堿性溶液中

與Cu2+螯合形成蛋白質-銅復合物，此復合物使酚試劑

的磷鉬酸還原，產生藍色化合物，同時在堿性條件下酚

試劑易被蛋白質中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸述原呈藍

色反應。在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比，

以蛋白質對照品溶液作標準曲線，采用比色法測定供試

品中蛋白質的含量。

本法靈敏度高，測定范圍為20?250Mg。但對本法產

生干擾的物質較多，對雙縮脲反應產生干擾的離子，同樣

容易干擾福林酚反應，且影響更大。如還原物質、酚類、

枸櫞酸、硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、甘氨酸、糖

類、甘油等均有干擾作用。

除另有規定外，按方法1操作；如有干擾物質時，除

另有規定外，按方法2 操作并需經方法學驗證。方法1:

試劑堿性銅試液取氫氧化鈉10g，碳酸鈉50g，

加水400ml使溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5g，加水

50ml使溶解，另取硫酸銅0.25g，加水30ml使溶解，將

兩液混合作為乙液。臨用前，合并甲、乙液，并加水

至 500mlo

對照品溶液的制備除另有規定外，取血清白蛋白

(牛）對照品或蛋白質含量測定國家標準品，加水溶解并

制成每l m l中含0. 2m g 的溶液。

供試品溶液的制備照各品種項下規定的方法制備

(蛋白質濃度應與對照品溶液基本一致）。

測定法 精密量取對照品溶液0. Oml、0. 2ml、

0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml (對照品溶液取用量可在

本法測定范圍內進行適當調整），分別置具塞試管中，各

加水至1.0ml，再分別加人堿性銅試液1.0ml，搖勻，室溫放置1 0分鐘，各加人福林酚試液[取福林試液中的貯

備液（2mol/L酸濃度）1 — 16] 4.0ml，立即混勻，室溫

放置3 0分鐘，照紫外-可見分光光度法（通則0401) ，在

6 5 0 n m的波長處測定吸光度；同時以0 號管作為空白。以

對照品溶液濃度與其相對應的吸光度計算線性回歸方程。

另精密量取供試品溶液適量，同法測定。從線性回歸方程

計算供試品溶液中的蛋白質濃度，并乘以稀釋倍數，

即得。

方法2:

測定前將脫氧膽酸鹽-三氯醋酸加人樣品中，通過將

蛋白質沉淀來去除干擾物質。這種方法也可用于將稀溶液

中的蛋白質濃集。

試劑試液A 取1 % 氫氧化鈉溶液200ml與5%碳

酸鈉溶液200ml混合，加水稀釋至500ml。

試液B 取2. 9 8 %二水合酒石酸二鈉溶液100ml與

1.25%硫酸銅溶液100ml混合，加水稀釋至250ml，臨用

新制。

試液C 取試液A 與試液B 按50 : 1 的比例混合，臨

用新制。

福林酚試液取福林試液中的貯備液（2mol/L酸濃

度）1— 2 (所配得的福林酚試液應滿足以下要求：取供試

品溶液1ml，加試液C 5 m l和配好的福林酚試液0. 5ml,

所得溶液的p H 值應為10. 3±0. 3。若溶液p H 值超出范

圍，應適當調整福林酚試液的稀釋倍數）。

去氧膽酸鈉試液取去氧膽酸鈉適量，加水制成每

l m l中含1. 5m g 的溶液。對照品溶液的制備除另有規定外，取血清白蛋白

(牛）對照品或蛋白質含量測定國家標準品適量，加水分

別制成每 lml 中含 0. OOmg、0. Olmg、0. 02m g、0. 03mg、

0. 04m g、0.05mg的溶液（對照品溶液濃度可在本法測定

范圍內進行適當調整）。

供試品溶液的制備照各品種項下規定的方法制備

(蛋白質濃度應與對照品溶液基本一致）。

測定法精密量取各對照品溶液1.0ml，分別置玻璃

試管中，加人去氧膽酸鈉試液0.1ml，渦旋混勻，室溫放

置10分鐘，加人7 2 %三氯醋酸溶液0.1ml，渦旋混勻，

在3000g■條件下離心3 0分鐘，輕輕倒出上清液，用吸管

將剩余液體移除。蛋白質沉淀用試液C lml復溶后，再加

人試液C 5ml，混勻，室溫放置10分鐘，加人福林酚試液

0 .5ml,立即混勻，室溫放置3 0分鐘，照紫外-可見分光

光度法（通則0401)，在7 5 0 n m的波長處測定吸光度；同

時以0 號管作為空白。以對照品溶液濃度與其相對應的吸

光度計算線性回歸方程。另精密量取供試品溶液1.0ml，

同法測定。從線性回歸方程計算供試品溶液中的蛋白質濃

度，并乘以稀釋倍數，即得。

第三法雙縮脲法

本法系依據蛋白質分子中含有的兩個以上肽鍵在堿性

溶液中與Cu2+形成紫紅色絡合物，在一定范圍內其顏色

深淺與蛋白質濃度呈正比，以蛋白質對照品溶液作標準曲

線，采用比色法測定供試品中蛋白質的含量。

本法快速、靈敏度低，測定范圍通常可達1?10mg。

本法干擾測定的物質主要有硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩

沖液和某些氨基酸等。

試劑雙縮脲試液取硫酸銅1.5g、酒石酸鉀鈉

6. O g和碘化鉀5.0g，加水500ml使溶解，邊攪拌邊加人

1 0 %氫氧化鈉溶液300ml，用水稀釋至1000ml,混勻，

即得。

對照品溶液的制備除另有規定外，取血清白蛋白

(牛）對照品或蛋白質含量測定國家標準品，加水溶解并

制成每l m l中含1 0 m g的溶液。

供試品溶液的制備照各品種項下規定的方法制備

(蛋白質濃度應與對照品溶液基本一致）。

測定法 精密量取對照品溶液0. Oml、0. 2ml、

0.4ml、0.6ml、0.8ml、1. Oml (對照品溶液取用量可在

本法測定范圍內進行適當調整），分別置具塞試管中，各

加水至1.0ml，再分別加人雙縮脲試液4. Oml，立即混勻，

室溫放置3 0分鐘，照紫外-可見分光光度法（通則0401),

在5 4 0 n m的波長處測定吸光度；同時以0 號管作為空白。

以對照品溶液濃度與其相對應的吸光度計算線性回歸方

程。另精密量取供試品溶液適量，同法操作。從線性回歸

方程計算供試品溶液中的蛋白質濃度，并乘以稀釋倍數，

即得。

第四法2,2'-聯喹啉-4,4'-二羧酸法（B C A法）

本法系依據蛋白質分子在堿性溶液中將Cu2+還原為

C u +，2，2〔聯喹啉-4，4'-二羧酸（B C A ) 與Cu4■結合形成紫

色復合物，在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正

比，以蛋白質對照品溶液作標準曲線，采用比色法測定供

試品中蛋白質的含量。

本法靈敏度較高，測定范圍可達80?400Mg。本法測

定的供試品中不能有還原劑和銅螯合物，否則干擾測定。

試劑銅- B C A試液取2，2。聯喹啉-4，4'-二羧酸鈉

lg，無水碳酸鈉2g，酒石酸鈉0. 16g，氫氧化鈉0. 4 g與

碳酸氫鈉0.95g，加水使溶解成100ml，調節p H 值至

11.25,作為甲液；另取4 % 硫酸銅溶液作為乙液。臨用

前取甲液100ml，加人乙液2ml，混勻，即得。

對照品溶液的制備除另有規定外，取血清白蛋白

(牛）對照品或蛋白質含量測定國家標準品，加水溶解并

制成每l m l中含0. 8 m g的溶液。

供試品溶液的制備照各品種項下規定的方法制備

(蛋白質濃度應與對照品溶液基本一致）。

測定法 精密量取對照品溶液0. Oml、0. lml、

0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml (對照品溶液取用量可在

本法測定范圍內進行適當調整），分別置具塞試管中，各

加水至0.5ml，再分別加人銅- B C A試液10. Oml，立即混

通則勻，置37°C水浴中保溫3 0分鐘，放冷，照紫外-可見分光

光度法（通則0401)，立即在562mn的波長處測定吸光度；

同時以0 號管作為空白。以對照品溶液濃度與其相對應的

吸光度計算線性回歸方程。另精密量取供試品溶液適量，

同法測定。從線性回歸方程計算供試品溶液中的蛋白質濃

度，并乘以稀釋倍數，即得。

第五法考馬斯亮藍法（Bradford法） •

本法系依據在酸性溶液中考馬斯亮藍G2 5 0與蛋白質分

子中的堿性氨基酸（精氨酸）和芳香族氨基酸結合形成藍色

復合物，在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比，以

蛋白質對照品溶液作標準曲線，采用比色法測定供試品中蛋

白質的含量。

本法靈敏度高，通常可測定1?200Mg 的蛋白質量。

本法主要的干擾物質有去污劑、Triton X-100、十二烷基

硫酸鈉（S D S )等，供試品緩沖液呈強堿性時也會影響

顯色。

試劑酸性染色液取考馬斯亮藍G250 0. lg，加乙

醇50ml溶解后，加磷酸100ml，加水稀釋至1000ml, 混

勻。濾過，取濾液，即得。本試劑應置棕色瓶內，如有沉

淀產生，使用前需經濾過。

對照品溶液的制備除另有規定外，取血清白蛋白

(牛）對照品或蛋白質含量測定國家標準品，加水溶解并

制成每l m l中含l m g的溶液。

供試品溶液的制備照各品種項下規定的方法制備

(蛋白質濃度應與對照品溶液基本一致）。

測定法精密量取對照品溶液0.0ml、0.01ml、0. 02ml,

0.04ml、0.06ml、0.08ml、0.1ml (對照品溶液取用量

可在本法測定范圍內進行適當調整），分別置具塞試管

中，各加水至0.1ml，再分別加人酸性染色液5.0ml，立

即混勻，照紫外-可見分光光度法（通則0401) ，立即在

5 9 5 n m的波長處測定吸光度；同時以0 號管作為空白。

以對照品溶液濃度與其相對應的吸光度計算線性回歸方

程。另精密量取供試品溶液適量，同法測定，從線性回

歸方程計算供試品溶液中的蛋白質濃度，并乘以稀釋倍

數，即得。

【附注】本法測定時不可使用可與染色物結合的比色

皿（如石英比色皿），建議使用玻璃比色皿或其他適宜材

料的比色皿。

第六法紫外-可見分光光度法

本法系依據蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸、色

氨酸等芳香族氨基酸，其在2 8 0 n m波長處具zui大吸光度，

在一定范圍內其吸光度大小與蛋白質濃度呈正比。

本法操作簡便快速，適用于純化蛋白質的檢測，一般

供試品濃度為0.2?2mg/ml。本法準確度較差，干擾物質

多。測定法（2) 適用于供試品溶液中存在核酸時的蛋白

質測定。

對照品溶液與供試品溶液的制備照各品種項下規定

通則52

的方法制備。

測定法 （1 )取供試品溶液，照紫外-可見分光光度

法（通則0401)，在2 8 0 n m的波長處測定吸光度，以吸收

系數法或對照品比較法計算供試品中蛋白質的含量。

( 2 )取供試品溶液，照紫外-可見分光光度法（通則

0401)，在28 0 n m與2 6 0 n m的波長處測定吸光度，按下式

計算供試品中蛋白質的含量。*

蛋白質濃度（mg/ml) =1. 4 5 X A 28。一0. 7 4 X A 260